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本制品是一种快速便捷的提取动物硬组织（如：骨骼肌）线粒体的试剂盒。本试剂盒在提取线粒体的同时，还能获得不含线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素c等线粒体蛋白向胞浆的释放。经本试剂盒获得的大部分线粒体都含有完整的内膜和外膜，且维持线粒体生理功能，因此，提取所得的线粒体可用于线粒体膜电位等生理功能相关研究。另外，提取得到的线粒体也可被线粒体裂解液或其它适当裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。本试剂盒适用于从动物硬组织（比如：心肌、骨骼肌）或其他难以分离线粒体的组织中提取线粒体。

• 进行实验之前务必阅读试剂盒操作流程，根据最终实验目的选择试剂盒内所要用到的试剂。
  
• 若不是用于制备线粒体蛋白样品，不必往线粒体裂解液和清洗液中加PMSF。
  
• 分离线粒体的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷，全部操作时间尽量控制在1h之内。
  
• 通常，在分离线粒体时前后两次离心速度选取1000g和12000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可以采用2000g和6000g。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以免影响后续实验效果。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 试剂准备：从冰箱取出所需试剂置于室温融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果实验目的是为了制备线粒体蛋白样品，需在线粒体裂解缓冲液和清洗液内添加100×蛋白酶抑制剂(PMSF)，使其终浓度为1×PMSF。PMSF一定要在试剂加入到样品前1～2min内加入，以免PMSF在水溶液中失效。
  
• 清洗：动物禁食24h后处死，取新鲜横纹肌等组织（不宜采用冻存组织），迅速称重50～100mg，用预冷的清洗液清洗2次，弃清洗液，于冰上剪成30mm2大小的组织碎片。
  
• 裂解：加入10倍体积预冷的线粒体裂解液，置于冰浴5～10min。
  
• 匀浆I：转移到预冷的Dounce匀浆器中，匀浆10～20次。或采用电动匀浆器，700rpm，8～10次。不同组织或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
  
  • 如果组织重量为100mg，可以粗略认为组织的体积接近100μL，此时需加入1mL线粒体裂解液。
• 匀浆II：4℃搅拌孵育5～10min。用等体积的线粒体储存液稀释至匀浆液，再次重复步骤4。
  
• 离心：用尼龙网或细胞筛网过滤匀浆液，4℃ 1000g离心15min，重复1次，以去除细胞核、未破碎细胞和大的膜碎片。
  
  • 如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为2000g离心10min，缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
• 上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000g离心10min。
  
  • 如需获得纯度更高的线粒体，可以将此步骤的离心速度改为6000g离心10min，缺点是相同数量细胞的线粒体抽提得率会下降。
• 弃上清，沉淀即为线粒体。
  
  • 如果希望获得去除线粒体后的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，且在收集上清的过程中不要触及沉淀，随后把收集的上清4℃ 12000g离心10min，此时的上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
• 保存：弃上清，用适当的缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能分析，线粒体沉淀需重悬于线粒体保存液中；如果用于细胞浆蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于1×蛋白保存液，即按照细胞浆蛋白∶5×蛋白保存液＝4∶1的比例混合；如果用于双向电泳，应使用其它适宜的保存液。
  
  • 使用本试剂盒中的线粒体储存液稀释或储存的线粒体样品应及时使用，以免线粒体膜电位受影响。如果不能及时使用，建议在-80℃保存。冻存后的线粒体样品不推荐用于膜电位的检测，但可以用线粒体蛋白或核酸的相关检测。